药物神经毒性非临床安全性评价方法和技术概

药物神经毒性非临床安全性评价方法和技术概述

来源

中国新药杂志年第30卷第4期

作者

田康，屈哲，吕建军，王雪，耿兴超，李波，黄芝瑛中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全评价研究北京市重点实验室中山大学药学院中国食品药品检定研究院

摘要

药物神经毒性非临床安全性评价是早期筛选神经毒性药物及降低药物研发风险的重要手段，而且能为后续的临床试验提供毒性证据支持。原国家食品药品监督管理总局(ChinaFoodandDrugAdminis-tration，CFDA)、经济合作与发展组织(OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment，OECD)的药物非临床安全性评价指导原则中涉及神经毒性及发育神经毒性研究的一般方法为啮齿类动物及非人灵长类动物实验的组织病理学检查和神经行为学检查。至今，动物实验技术已经从传统的显微镜微观检查形态发展到活体成像技术。随着国内外倡导动物福利和3Ｒ原则，即减少(reduction)、替代(replacement)和优化(refinement)，以及体外替代模型的不断出现，将各种体外评价方法和技术，如神经细胞成像技术、神经电生理技术、组学技术等，经过验证后用于监管科学领域已成为国内外药物非临床安全性评价工作者努力的方向。但是，无论是体内试验还是体外替代方法都无法全面评价神经毒物的潜在风险，因此只有将适合的方法有效地结合才能在非临床准确、高效地评价药物的神经毒性。

关键词

神经毒性;非临床安全性评价;动物实验;体外评价;技术和方法_正文_众所周知，神经毒性是药物非临床安全性评价的重要内容。在美国FDA注册的约种人类处方用药中约个存在神经毒性相关问题［1］，因此药物神经毒性的非临床安全性评价以及对后续临床试验时可能出现的神经毒性进行预测尤为重要。目前，药物神经毒性非临床安全性评价主要依靠动物实验的组织病理学检查和神经行为学检查。其中，神经行为学检查是通过多种测试项目及组合反映神经功能状态，是评价药物神经毒性、药理作用的敏感指标。组织病理学检查啮齿类动物和非人灵长类动物神经系统组织，如大脑皮质、海马、纹状体、小脑等，用于判断神经损伤的特定部位和程度，主要采用光学显微镜及电子显微镜技术进行组织结构和超微结构检查。通过苏木精-伊红(HematoxylinEosin，HE)染色切片显微镜下检查大部分神经病变，特异性神经病变可进一步采取免疫组化或特殊染色进行识别。电镜技术用于观察细胞表面形态和细胞内超微结构，如鉴别细胞器中空泡变性的具体位置。此外，各类神经影像学技术如磁共振成像(magneticresonanceimaging，MＲI)、正电子发射断层扫描(pos-itronemissiontomography，PET)等也适用于不同研究目的动物活体成像。MＲI的优势是分辨率高、电离辐射低，PET是分子定量成像技术，可与结构成像互补。各种体内评价方法和技术的不断发展推动了药物神经毒性非临床动物实验研究。近年来，随着毒理学研究领域新技术新方法的不断涌现，体外替代方法用于神经毒性早期筛选和毒理机制研究也逐渐被监管机构所采纳。通过构建和验证各种体外模型(如神经细胞系模型、原代细胞培养模型、人源干细胞模型等)，标准化各项评价技术(如神经细胞成像技术、神经电生理学技术、组学技术等)，期待能替代或部分替代动物实验用于药物监管。总之，神经毒性评价技术应用领域广泛、各具优势，任何一种技术尚不能全面评价药物的神经毒性。本文通过概述药物神经毒性非临床安全性评价方法和技术，以期为我国从事药物神经毒性非临床安全性评价人员提供一定参考。

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体内评价方法和技术

经济合作与发展组织(OECD)指南中要求通过动物实验的临床观察、组织病理学检查、神经功能测试来确定神经毒物，表征神经系统改变，评价所用剂量水平及神经系统功能、行为和形态学改变［2－3］。而实现上述指南要求需要开展以下动物实验神经毒性评价方法。1．1组织病理学评价方法组织病理学检查是药物非临床神经毒性评价的“金标准”，病理形态或者组织化学改变是确认神经损伤及其病变可逆性程度的重要手段。一般研究思路是先进行肉眼大体观察，并辅以脑的绝对和相对重量，然后按国际相关指南在光学显微镜下检查啮齿类动物7个、猴5个脑组织切片的病变性质、区域及程度［4］。如需进一步确认病变性质，可另外取材进行电镜检查。为了确认神经毒性的细胞特异性及某些特殊生化过程的影响，可以使用组织化学等方法进行检查。1．1．1光学显微镜检查神经组织病变光学显微镜观察是最常用的神经组织病变检查方法，常见神经组织病理学改变主要涉及神经元、神经纤维和神经胶质细胞。神经元变性/坏死在HE染色切片可见胞体萎缩，胞质呈明亮的粉红色，细胞核变暗、固缩。但药物相关的神经元坏死很难与人工假象相区别，采用特殊染色方法氨基铜银染色和Fluoro-JadeB染色［5］，将坏死的神经元和突起标记为黑色，与黄色背景形成对比，很大程度提高了评价的准确性。显微镜下观察神经元尼氏体溶解可见神经细胞肿胀，圆形，胞核偏位，胞浆中央的尼氏体崩解为细尘状颗粒，胞浆着色浅呈苍白均质状［6］。HE染色切片很难发现神经纤维的脱髓鞘病变。用四氧化锇固定，塑料或树脂(如Spurr树脂或环氧树脂)包埋，甲苯胺蓝染色，能较好地显示髓鞘的细微结构［7］。胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)染色能提高星形胶质细胞的可视化，有效地确定星形胶质细胞的数量是否增多。此外，通过免疫组织化学染色可以鉴别“卫星现象”中的少突胶质细胞、小胶质细胞还是星形胶质细胞。1．1．2电镜技术检查超微结构改变和一般光学显微镜相比，电子显微镜具有超高的分辨率，对于亚细胞结构变化的观察有独特优势。目前用于组织病理学检查的主要有透射电镜和扫描电镜。透射电镜注重观察组织和细胞内的超微结构，扫描电镜则用于观察组织和细胞的表面形貌。应用透射电镜观测神经组织超微结构，如脱髓鞘病变、无髓神经纤维、突触小泡和中枢神经系统空泡的具体位置，可以直接反映神经组织的生理状态。扫描电镜采集图像的立体感强，在观察神经组织中的血管分布、神经纤维的缠结、神经回路具有独特优势。1．2神经行为学评价神经行为学评价是OECD推荐的神经毒性评价的重要方法之一［8］。行为毒性表现为在神经系统受损后，感觉、学习和记忆、运动等中枢神经系统的功能障碍。一般毒性是器质性的损伤而引起明显的功能性变化，但是仅表现功能性改变并未出现明显的器质性损伤的情况下，可以依靠行为学检查方法进行评价。在药物安全性评价中，神经行为学评价可首先与一般毒性评价相结合，筛查药物可能引起的神经毒理学作用，为是否进一步开展安全药理学评价提供参考。安全药理学中的神经行为学评价通常采用功能观察组合试验(functionalobservationbattery，FOB)。原国家食品药品监督管理总局(CFDA)要求定性和定量评价给药后动物的运动功能、行为改变、协调功能、感觉/运动反射和体温的变化等，以确定药物对中枢神经系统的影响［9］。此外，具有潜在成瘾性的药物依赖性评价也通过神经行为学方法，研究给药后动物抑郁、焦虑、运动功能、学习记忆、动机行为改变等，常用的评估方法有自然戒断试验、催促戒断试验、行为敏化试验、条件性位置偏爱试验等［10］。神经行为学方法还适用于发育神经毒性评价，非人灵长类动物神经行为学的测试方法(包括学习记忆能力、计划控制行为、信息处理能力、社会行为、感知功能、视觉-运动协调能力以及视觉空间定位能力)［11］，比啮齿类动物更适合研究发育神经毒性。对行为毒性试验来说，化学物质的吸收、代谢和排泄等方面与特定动物神经系统敏感性相关，因此原则上选择敏感动物及生理学和动物学上与人类更接近的动物进行神经行为学评价。1．3神经影像学技术在中枢神经系统疾病的研究过程中，神经影像学技术可以无创地在活体动物上反映时间及空间维度的信息，是观察生理及病理状态下大脑结构的重要方法。神经影像学技术主要包括神经结构成像技术如MＲI以及分子定量神经影像学技术如PET。MＲI是利用原子核在强磁场内发生共振产生的信号将图像重建的一种成像技术，其优势是分辨率高和低电离辐射。MＲI技术已开发出各种具有特殊功能的成像技术，例如弥散加权成像(diffusionweightedimaging，DWI)可实现对动物的中枢神经纤维精细成像，用于大脑发育及衰老、脑白质变性等疾病模型的检测［12］。磁敏感加权成像(susceptibilityweightedimaging，SWI)对磁化因素最为敏感，对血液制品、铁和钙等顺磁性物质具有极高敏感性，有报道用来检测大鼠大脑微出血模型短期的动态变化［13］。灌注加权成像(perfusionweightedimaging，PWI)能反映血流通过组织血管网的情况，主要用于检测脑血管瘤、脑梗塞、脑缺血再灌注评估［14］。酰胺质子转移加权成像(amideprotontransfer-weightedimaging，APTWI)则在脑肿瘤成像中显示出良好的应用前景［15］。PET是一种分子定量成像技术，需要含正电子的物质与细胞代谢需要的物质结合成放射性示踪剂，最常用的是18-氟脱氧葡萄糖。因此可根据试验要求灵活设计特异性示踪剂定量检测目标，如通过标记的对氟苯甲醛丹酰肼的膜联蛋白V(annexinV)跟踪细胞凋亡［16］。有报道应用PET检测大鼠模型中药物处理后多巴胺受体和谷氨酸受体及2种神经递质的胞外利用率的变化［17］。内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明来源于凡默谷

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